核酸檢測室氣溶膠產生及預防

    核酸檢測實驗是微觀的，基于細胞，分子，蛋白水平，而這些微觀樣本對外界環境的影響敏感，比如溫度、ph值、酶解、損傷等，在我們盡力呵護樣本的生存環境的同時，污染也是需要注意的頭等大事，要堅決避免環境中的“雜質”的亂入，包括樣本污染，試劑儀器交叉污染、產物氣溶膠污染等對實驗結果的影響。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，防不勝防，假陽性結果讓無數核酸檢測人員抓狂和崩潰。
   一旦出現實驗室環境污染，比如樣本之間交叉污染、試劑污染、儀器污染、陽性對照污染、PCR擴增產物污染、氣溶膠污染等，其中氣溶膠污染是一個非常重要而被忽視的污染源。實驗室出現氣溶膠污染，需要較長的時間進行*。
 
一、氣溶膠污染原因
1、樣本之間交叉污染。
標本污染主要有收集標本的容器被污染；標本存放運輸時，由于密封不嚴或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；核酸模板在提取過程中，由于加樣槍污染導致標本間污染；手動提取核酸樣本時，污染的手套觸摸離心管內蓋導致的污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
2、PCR試劑污染
PCR試劑在配制過程中，移液槍、槍頭、離心管等原因造成試劑被PCR核酸模板污染。
3、不同工作區域移液槍等耗材交叉使用。
 將易污染區域的移液槍、槍頭、離心管等耗材拿到潔凈區使用引起的污染；
4、離心機轉子未定期擦拭。
離心機通常進行各種試劑組分、不同盲樣的離心，如果離心管外部沾染病毒、陽性核酸或陽性質粒，容易造成污染。
5、陽性對照造成的污染。
開蓋時間過長高濃度質粒揮發到室內，陽性對照組分未使用完任意丟棄，加完陽性對照的槍頭未放入消毒液中。
6、擴增產物開蓋造成的污染。
這是PCR試驗中主要、常見的污染原因。因為PCR產物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測拷貝的極限，PCR產物開蓋后，極易迅速造成擴散，極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。
7、各個實驗室擦桌布、掃把，簸箕，工作服交叉使用。
 
二、核酸檢測實驗室如何預防污染
1、合理的實驗分區
原則上可以設置3個獨立的工作區域：
試劑耗材儲存與準備區、標本處理和標本準備區（核酸純化）、擴增檢測區，各區域空間*相互獨立，不能直接相通。其中試劑耗材儲存與準備區必須獨立設置。
實驗室實施空氣流向控制，擴增前和擴增后區域應具有獨立通風系統，擴增后區域保持負壓狀態，其它區域保持正壓狀態，防止擴增產物進入擴增前的區域。
 
2、實驗操作流程：
（1）樣品制備區進行樣品處理，核酸提取；
（2）配液區配置反應體系：酶混合液和PCR反應液混合，分裝至PCR反應管；
（3）樣品制備區加樣：樣品核酸和陰陽性對照加至反應液中；
（4）PCR擴增區上機擴增檢測。務必保持單向操作流程，避免各區實驗室污染。
3、各個實驗區內試驗用品專區
配液區是潔凈的試驗區域，樣品制備區的潔凈度稍差， PCR擴增區內是易被污染的區域，各區之間試驗物品專區，避免因交叉使用造成實驗室污染。
4、試驗操作要規范
    （1）正確使用移液槍，保證試劑配比和計量正確，同時避免液體吸入移液槍口造成污染。
    （2）實驗的過程中應勤換手套，在進出不同區域或進行模板操作后，都應及時更換手套。
    （3）試劑盒各組分在打開之前應先做瞬時離心(約10s)，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部，從而減少污染手套或加樣器的機會。開管動作要輕，以防管內液體濺出或形成氣溶膠，造成污染。
    （4）樣本量較多時，應將反應液預混，再分裝至PCR反應管，后添加核酸模板，以減少單個添加操作繁瑣造成的污染。
    （5）每次試驗必須設定陰性對照和陽性對照，讀取結果時，在保證陰陽性對照均成立的情況下，判讀樣本結果才有效。
（6）實驗結束后，PCR反應管嚴禁打開，及時放置殺孢子劑消毒液中浸泡。
 
三、解決核酸實驗室污染方法
（1）開窗通風：如在短時間內要消除實驗室污染，開窗通風促進實驗室內空氣流通，使停留在室內的核酸排放到室外。
（2）紫外燈照射：將實驗室內好生物安全柜內物品平鋪，打開離心機內蓋，然后將紫外等打開照射12-24小時，通風12小時以上。
（3）消毒液降解核酸：及時用諾福過氧化氫殺孢子劑擦拭操作臺面和儀器，按照1:10稀釋浸泡試驗器具，同時按照1:3比例稀釋涮洗拖布擦拭地面。
（4）高壓：試驗耗材、工作衣等進行121℃30分鐘高壓。

（5）使用核酸污染清洗液噴灑室內降解核酸。

（6）陽性污染特別嚴重，可以采取干霧過氧化氫消毒熏蒸實驗室。

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